NHS 活化的琼脂糖磁珠（Magarose-NHS）将蛋白质简单有效地共价固定到磁珠载体上，为抗体、抗原或其他生物分子的亲和纯化提供了有价值的方法。活化的琼脂糖磁珠含有能够与蛋白质或其他分子上的伯胺反应形成稳定的酰胺键的 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）官能团。耦合反应在 pH 7~9 的无胺缓冲液中进行。不管配体的分子量或等电点（PI）耦合反应的效率均大于 80%。一旦配体被固定，所制备的琼脂糖磁珠即可以被应用到多重亲和纯化程序中。 

英文名称：Magarose-NHS

中文名称：NHS活化琼脂糖磁珠

      NHS琼脂糖微球

磁珠浓度：25% (v/v)  in 异丙醇

配基密度：~ 50 μmol NHS/ ml磁珠

介质：6%交联磁性琼脂糖

粒径：20-45μm

配体结合：>20 mg IgG/ml磁珠

保存：2~8℃

NHS- Activated Magarose Beads 是一种预活化的琼脂糖磁性微球，可以直接用于含氨基的蛋白或多肽的耦联。预活化介质可以根据需要制备成***亲和介质，快速有效地从复 杂体系中一步纯化相应的物质。

使用方法

1. 缓冲液

所有的水和缓冲液均用 0.22 μm 或 0.45 μm 的滤膜进行过滤。

1)Washing Buffer A: 1 mM 盐酸，使用前冷却到 4?C;

2)Coupling Buffer A: 100 mM 2-吗啉乙磺酸 MES，pH 4.8（用于等电点小于 7 的生物分子的偶联）;

3)Coupling Buffer B: 200 mM NaHCO3， pH 8.3（用于等电点大于 7 的生物分子的偶联）;

4)Blocking Buffer: 3 M 乙醇胺，pH 9.0;

5)Storage Buffer: 含质量分数为 0.05%叠氮化钠的 PBS 缓冲液或者根据客户自己需求采用其他缓冲液。

2. 流程关键点

1)其中磁珠洗涤要严格按照说明书采用冷却的 Washing Buffer A快速洗涤 ，以防磁珠在洗涤过程中 NHS 基团水解；

2)蛋白偶联过程中，首先要通过实验确定合适的 Coupling Buffer（主要包括 Coupling Buffer A 、Coupling Buffer B）、50 mM 硼酸溶液pH 8.5、100mM磷酸缓冲液，100mM NaCl，pH7.4这四种）；

3)确定合适的Coupling Buffer后，再以此Coupling Buffer 为基础，确定合适的偶联蛋白浓度，因为蛋白浓度越高，偶联到磁珠上的蛋白的量会越大（这是由于 NHS 基团跟蛋白偶联和 NHS 基团本身水解是一对竞争反应）。当然此处要综合考虑使用性能和成本，有些客户偶联少量的蛋白便可满足使用需求，这时采用低浓度的蛋白便可，这样可以降***。

4)封闭这一步可以采用3 M 乙醇胺，也可使用 Tris 缓冲液（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0），封闭时间不得低于 2 h，如果化学封闭后背景仍然很高，还可以额外加一步 BSA 封闭。

3. 蛋白偶联操作步骤

以下操作过程以取磁珠样品 400 μL，采用 1.5 mL EP 管为例介绍。用户可根据自身需求按比例调整。

蛋白溶液配制：取适量待偶联蛋白用 Coupling Buffer 溶解，配成浓度为≥3.0 mg/mL 的蛋白溶液。已经保存于 buffer中的蛋白，需要通过透析或者脱盐的方法***除去原有 buffer 里含伯胺基的物质，然后再用 Coupling Buffer 配成浓度为≥3.0 mg/mL 的蛋白溶液，将配制好的蛋白溶液于4℃保存备用。

注： (1)为达到更好的性能，蛋白浓度≥3.0 mg/mL，这样偶联效率会更高，此处需综合考虑成本和使用要求； (2)蛋白溶液中不能含有带伯氨基的成分，比如 Tris，甘氨酸，明胶，BSA 等；

1)取 400 μL 25%磁珠悬浮液于 1.5 mL EP 管中。磁分离，去除上清液。

注：磁珠取样前要反复颠倒、使用涡旋振荡器使其混合均匀，以保证实验的同一性，每取一次样需要重新混匀。

2)加 1 mL 2~8℃的 Washing Buffer A于离心管中，涡旋 15 s，使磁珠混合均匀。将 EP 管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。

3)加 200 μL 蛋白溶液于 EP 管中，涡旋 30 s，使其混合均匀。

注：磁珠洗涤后要立即加入蛋白溶液。

4)将 EP 管涡旋 15 s，置于垂直混合仪上，室温混合 2~4 h。如果垂直混合不均匀，则反应前 30 min，每隔5 min 取下 EP 管涡旋 15 s。此后，每隔 15 min，取下 EP 管涡旋 15 s。

注：如有需要可以在 4?C 反应过夜。

5)采用磁性分离架富集磁珠，保存上清。加 1 mL Blocking Buffer于 EP 管中，涡旋 30 s，将 EP 管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。

注：Blocking Buffer除了试剂盒中提供的 3 M 乙醇胺外，也可以使用 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0 等其它封端试剂。

6)加 1 mL Blocking Buffer于 EP 管中，涡旋 30 s，将 EP 管置垂直混合仪中室温反应2 h。将 EP 管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。

7)加 1 mL 超纯水于 EP 管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。

8)加 1 mL Storage Buffer（比如含 0.05%叠氮化钠的 PBS 缓冲液，或者客户根据自己实际需求选合适的保存溶液 ）于 EP 管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作 2 次。

9)加入 400 μL Storage Buffer于 EP 管中，充分混合，4?C 保存备用。

偶联用琼脂糖磁珠

羧基活化琼脂糖磁珠|羧基琼脂糖微球|Magarose-COOH

氨基活化琼脂糖磁珠|氨基琼脂糖微球|Magarose-NH2

NHS活化琼脂糖磁珠|NHS琼脂糖微球|Magarose-NHS

环氧基活化琼脂糖磁珠|环氧基琼脂糖微球|Magarose-Epoxy

CNBr活化琼脂糖磁珠|CNBr琼脂糖微球|Magarose-CNBr

醛基活化琼脂糖磁珠|醛基琼脂糖微球|Magarose-CHO

琼脂糖磁性微球|琼脂糖磁珠|Magnetic agarose bead

蛋白纯化琼脂糖磁珠

Protein A/G包被琼脂糖磁珠|Protein A/G包被琼脂糖微球|Magarose-ProA/G

Strep-tag II蛋白纯化磁珠|Strep-Tactin琼脂糖磁性微球

DEAE弱阴离子交换琼脂糖磁珠

肝素包被琼脂糖磁珠|Heparin包被琼脂糖微球

GST融合蛋白纯化用琼脂糖磁珠

His-tag标签蛋白纯化磁珠Magarose TED

组氨酸标签蛋白纯化磁珠|Magarose NTA

His标签蛋白纯化磁珠|Magarose IDA

羧基磁珠|羧基磁性微球|羧基磁性纳米粒子

Fe3O4磁核|超顺磁性纳米氧化铁|铁氧体磁珠|200-400nm磁性纳米粒子

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