同位素未标记13C标记和2H标记的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）处理拟南芥属T87细胞
建立高准确度和普适性的外源性代谢物检测和鉴定分析方法对于评价药物等化合物的安全性至关重要。基于液相色谱-四极杆串联高分辨质谱技术（LC/HRMS/MS），先应用稳定同位素标记目标原型化合物（13C和2H），再进行特征峰识别和配对同位素峰过滤鉴定代谢物，通过代谢物随时间变化的轮廓分析确证代谢物，建立了高准确度的外源性代谢物检测和鉴定分析方法。
该研究使用未标记、13C标记和2H标记的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）处理拟南芥属T87细胞，经液相色谱高分辨质谱分析后进行特征峰识别和配对同位素峰过滤，得到83个候选代谢物，确认了26个2,4-D的代谢物，其中包括10个已报道代谢物和16个新发现的代谢物。
具体研究策略见图1。
该研究共包括三个数据集：
1、未加药组和2,4-D给药组；
2、2,4-D给药组和13C8-2,4-D给药组；
3、2,4-D给药组和2H5-2,4-D给药组，每组细胞样品均在加药0、1、3、7和10天时间点取样分析。经质谱分析后数据集1得到30853个特征峰，扣除未加药组内源性特征峰并进行35Cl/37Cl同位素表型分析后，得到潜在代谢物645个，但这其中仍可能包含大量假阳性结果；数据集2得到34559个特征峰，对2,4-D给药组和13C8-2,4-D给药组在0、1、3、7和10天时间点的特征峰峰面积轮廓进行统计分析（火山图分析，log2-fold change>|1|和p<0.05）排除内源性代谢物，得到差异特征峰1626个，再进行同位素特征峰配对过滤（Δm/z 8.0272 Da，质量偏差＜5ppm），得到候选代谢物81个；数据集3分析处理流程与数据集2相同，得到候选代谢物76个。综合数据集2和数据集3数据，总共得到候选代谢物83个，三个数据集分析流程见图2。
数据集分析流程（a, 数据集1；b, 数据集2；c, 数据集3）
对83个候选代谢物进行了鉴定，通过Metabolizer软件预测了2,4-D可能的所有代谢反应和代谢产物，包括Ⅰ相代谢（氧化/脱烷基化/羟基化）和Ⅱ相代谢（葡萄糖醛酸结合/氨基酸结合/谷胱甘肽结合/硫酸结合）反应，得到7029个推测代谢物。将83个候选代谢物高分辨质谱数据与推测代谢物进行比对（质量偏差＜5ppm），鉴定得到了26个代谢物，其中包括10个已报道代谢物和16个新发现的代谢物。通过二级质谱特征离子先终确证了16个新发现代谢物的结构。图3为推测的2,4-D在T87细胞内的代谢途径和代谢物随时间变化的代谢轮廓。
图3 推测的2,4-D代谢途径（a）和部分代谢物随时间变化的代谢轮廓（b）
根据代谢反应的不同将鉴定的代谢物分为6组（A-F）。根据每组外源性代谢物随时间变化代谢轮廓的不同进一步对鉴定的26个代谢物进行了确证（见图4）。
图4 各组代谢物（A-F）随时间变化的代谢轮廓分析
该研究建立的基于稳定同位素标记和代谢物随时间变化的代谢轮廓分析方法有助于外源性代谢物在生物体内的准确检测和鉴定，可有效减少假阳性率，为全面的外源性代谢物的高通量鉴定提供了参考。
CAS# 名称 CAS#(未标记)
苯甲醛-环-D5
65-57-5 溴苯-D5,98 atom % 108-86-1
氯苯-D5,98 atom % 108-90-7
1228182-46-4 盐酸氯丙嗪-D6,98 atom % 69-09-0
85448-30-2 邻苯二甲酸二甲酯-D6 131-11-3
氘代的氨基甲酸乙酯 51-79-6
氘代苯酚 108-95-2
75-65-0
75-64-9
4019-61-8 N,N-二甲基苯胺--D6 121-69-7
14128-54-2 氘代锂铝,98 atom % 16853-85-3
865-50-9 氘代碘甲烷 氘代碘甲烷，同位素试剂
CAS# 名称 CAS#(未标记)
1632-98-0 乙醛-13C2 75-07-0
1563-79-7 乙酸-1-13C
1563-80-0 乙酸-2-13C,98 atom % 64-19-7
16651-47-1 乙酸-13C2,98 atom %
35121-31-4 乙炔-13C2,98 atom % 74-86-2
51956-33-3 碳酸钡-13C 513-77-9
32488-44-1 苯-13C6 71-43-2
3880-99-7 苯甲酸-羧基-13C，98 atom % 65-85-0
1111-72-4 二氧化碳-13C 124-38-9
1641-69-6 一氧化碳-13C,98 atom % 211-128-3
70753-79-6 乙醇-13C2 64-17-5
65402-55-3 三辛酸甘油酯-1,1,1-C13 538-23-8
110187-42-3 葡萄糖-13C6,98 atom % 492-62-6
58454-07-2 己酸-1-13C 142-62-1
14742-26-8 甲醇-13C 67-56-1
59669-16-8 辛酸-1-13C 124-07-2
72156-72-0 乙酰对氨苯乙醚乙氧基-1-13C 62-44-2
23424-28-4 乙酸钠-1-13C
13291-89-9 乙酸钠-2-13C
56374-56-2 乙酸钠-13C2 127-09-3
23102-86-5 甲酸-13C 钠盐 141-53-7
201612-61-5 辛酸钠-13C 1984/6/1
72156-70-8 美沙西汀-甲氧基-13C
H-LC006 1-氨基海因盐酸盐-13C,98 atom %
H-LC013 胆甾醇辛酸酯-13C 1182-42-9
CAS# 名称 CAS#(未标记)
14314-42-2 氧-18水 18O>98%
重氢重氧双标水18O>97% 7732-18-5
32767-18-3 氧气-18O,97 ATOM % 18O 7782-44-7
CAS# 名称 CAS#(未标记)
39466-62-1 氯化铵-15N 12125-02-9
43086-58-4 硫酸铵-15N2 7783-20-2
31432-48-1 铵态硝酸铵-15N
31432-46-9 硝态硝酸铵-15N 6484-52-2
57654-83-8 硝酸钾-15N 7757-79-1
68378-96-1 亚硝酸钠-15N 7632-00-0
31432-44-7 硝酸钙-15N2 10124-37-5
2067-80-3 尿素-15N2 57-13-6
287488-11-3 磷酸二氢铵-15N 7722-76-1
287488-13-5 磷酸氢二铵-15N2
29817-79-6 氮气-15N2 7727-37-9
86451-35-6 乙酸铵-15N 631-61-8
20509-24-4 氧化亚氮-15N 10024-97-2
1449-72-5 乙酰胺-15N 60-35-5
7022-92-6 苯胺-15N 62-53-3
92877-34-4 乙酰氨基丙二酸二乙酯-15N 1068-90-2
145571-73-9 水合肼-15N2 7803-57-8
40711-48-6 盐酸羟胺-15N 5470/11/1
25713-23-9 L-丙氨酸-15N 56-41-7
3715-16-0 L-天冬氨酸-15N 56-84-8
748757-99-5 L-天冬酰胺- 15N2 70-47-3
21160-87-2 L-谷氨酸-15N 56-86-0
204451-48-9 L-谷氨酰胺-15N2 56-85-9
7299-33-4 甘氨酸-15N 56-40-6
59935-30-7 L-异亮氨酸-N 73-32-5
59935-31-8 L-亮氨酸-15N 61-90-5
29700-34-3 L-苯丙氨酸-15N 63-91-2
59935-32-9 L-丝氨酸-15N 56-45-1
80681-09-0 L-苏氨酸-15N 72-19-5
35424-81-8 L-酪氨酸-15N
139952-87-7 Boc-丙氨酸-15N 15761-38-3
106665-75-2 BOC-甘氨酸-15N 4530-20-5
117398-49-9 Fmoc-L-丙氨酸-15N 35661-39-3
287484-33-7 Fmoc-L-天冬氨酸-15N 119062-05-4
125700-33-6 Fmoc-甘氨酸-15N 29022-11-5
200937-57-1 Fmoc-L-亮氨酸-15N 35661-60-0
125700-35-8 Fmoc-L-缬氨酸-15N 68858-20-8
H-LC007 1-氨基海因盐酸盐-13C,15N3 2827-56-7
wyf 12.23