试图揣测作者的思考方式

Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing
这篇文章[1]的一个亮点在于对肿瘤中的T细胞有了认识。

data

不得不说，这个样本的数量和质量真的太好了，一共是六个病人的外周血，正常组织，癌症区域配对样本，形成了非常好的对照。不知道是不是因为P1202病人T细胞的数量太少的缘故，文章最后没有对这个样本进行分析。

技术

scRNA-seq 是单细胞测序技术，这个技术测量单细胞的表达谱，有利于对细胞进行分类

TCR-seq 对T细胞有特有的TCR区域进行测序可以追踪T细胞的来源，也就是克隆情况，正常情况下，每个T细胞的TCR都是不一样的，但是在外界刺激的情况下，某些T细胞会选择性扩增，这个时候克隆产生的T细胞的TCR就是一样的。
基于这个原理，可以跟踪T细胞的演变情况。[2]

motivation、result and methods

motivation : 观察癌细胞的T细胞和正常的细胞有什么区别，从而为寻找免疫治疗的靶点提供思路。

result:
1、对T细胞进行了细致的分类，如下图所示，T细胞的分类和之前的分类差不多，多分出来的类别要么和肿瘤相关（C8_CD4-CTLA4），也就是在正常的样本中数目特别少，要么是肿瘤之前的一个精确的状态（C5_CD8-GZMK，C9_CD4-GZMA）。

2、对HCC浸润的Treg和耗竭型T细胞进行了进一步的分析，发现了一些之前就存在的marker，同时也找到了一些新的marker。这个地方做了一件比较重要的事情，就是跨癌症比较，发现这些marker在不同的癌症*享。最重要的是，找到了两个细胞类型共有的marker。横轴是耗竭型T细胞的marker，纵轴是Treg的markers。右上角是两者共有的marker。

3、对共有marker的LAYN进行了进一步的分析，可能是因为这种基因编码蛋白质，便于后期检测。文章是怎么证明自己的结论的呢？首先根据之前文献的报道，发现Helios基因对于Treg具有稳定作用，作者又发现LAYN只在FOXP3+Helicos+细胞中高表达，于是证明LAYN在更稳定的Treg中表达。进一步，加入质粒载入这个基因，发现载入之后IFN-\(\gamma\)蛋白高表达，证明的确能够抑制T细胞作用。

4、发现CD8+的T细胞和Treg细胞克隆在肿瘤中富集

5、对T细胞用monocle进行了时序排列，结合TCR对T细胞的时序进行分析,TCR的作用是证明这个时序的正确性，如果真的是由这种细胞过度过去的，那么就会共享很多的TCR，也就是共享的克隆型比较多。

６、对肿瘤区域的克隆型T细胞进行了分析，发现危重病人的克隆型Treg占据的比例更高，同时发现了这样一个亚群CD8+FOXP3+，分析克隆发现是，CD8+FOXP3-的细胞分化而来， Tregs and exhausted
CD4 T cell clusters 共享很少，indicated the potential conversion from exhausted CD4 T cells to inducible Tregs。

最后看一下文章的框图也就是文章主要做的事情和主要的发现

对我们的启发

1、在对细胞进行分类的时候，最开始文章分得特别粗，就分了三类，我们也可以先大概分类，后面再进行更细致的分类，分类的时候只要可以找到marker也可以多分几类,说不定一不小心就找到了一个中间状态的亚群，但是这也是基于对现有的文献充分调研。
2、发现一些两类marker均表达的细胞类型，不要苦恼，这就是一个发现，说明这个细胞说不定拥有两种细胞类型的特性，也不失为一种新的类型。
3、有克隆型可以说是分化，没有克隆型相似就说是转化，conversion这个词真的是震惊到我了，反正怎么都能说，结果合理解释即可。

存在的一些疑问

后期再填坑吧
文章中仿佛并没有去batch，而是直接将所有的细胞直接聚类，是因为数据的质量太好，还是因为本来就没有多大的batch呢？
T细胞应该分几类怎么选的呢？手动调节然后看marker的吗？

参考文献：
1、Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing
1、https://www.jianshu.com/p/0c47b9731e3d

Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing 文献概述