官方并没有一个很详细的文档描述Bionano的从头组装流程的具体过程，所以我只能根据自己实际项目进行介绍:

1. AutoNoise + SplitBNX: 这一步会将bnx和参考的cmap文件进行比对，估算出噪声系数，然后把bnx进行拆分便与后续比对
2. Pairwse: 这一步进行molecules之间的两两比较，寻找overlap, 结果存放在"align"文件夹下
3. Assembly: 根据两两比对结果，通过OLC算法进行组装，结果在"contigs/exp_unrefined"下，合并后的文件为"EXP_UNREFINED.cmap", 同时还会将"EXP_UNREFINED.cmap"和参考基因组的cmap进行比对，结果放在"contigs/exp_unrefined/exp_unrefined/alignref", 此外还将拆分后Bnx文件和参考基因组的cmap文件进行比对，结果放在"contigs/alignmolvref"下
4. refineA: 第3步得到的图谱先会进行第一次优化 输出结果在"contigs/exp_refineA", 这一步不会使用所有的原始数据，而是pairwise阶段用的质量比较好的分子，所以速度会快一些
5. refineB: 在第4步的基础上进行第二次的优化, 输出结果在"contigs/exp_refineB0"和"contigs/exp_refineB1". 这一步会使用所有的输入原始数据，速度稍微慢一些。第一轮和第二轮的结果会将地覆盖度的区域进行打断，然后更新标记和标记的位置。
6. Extension and merge: 将上一步的contig回贴到参考基因组的map，进行延伸和合并,这一步可以迭代3-5次。中间结果在"contigs/exp_extensionX_X"和"contigs/exp_mrgX"
7. Final refinement: 最后一步的优化
8. SV Decetion: 在有参考基因组的前提下，最后还会寻找一些大规模的结构变异。

上述这些流程由Solve工具中Pipeline文件夹下的脚本pipelineCL.py进行控制，以之前的过滤后的人类数据为例

python /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/Pipeline/10252018/pipelineCL.py \
    -T 96 -N 4 -f 1 \
    -i 5 \ # 延伸和合并的迭代次数，默认是1，介于0~20之间
    -b molecules120k.bnx \ # 输入的BNX文件
    -r NA12878_CTTAAG_0kb_0labels.cmap  \ #参考的reference，可选
    -l Assembly \ # 输出文件夹
    -y \   # 自动确定噪声参数，需要-r
    -t /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/RefAligner/7915.7989rel \ # RefAligner和Assembler的所在文件夹
    -a /opt/biosoft/Solve3.3_10252018/RefAligner/7915.7989rel/optArguments_nonhaplotype_saphyr_human.xml # 配置参数文件

上面的-a参数最为重要，因为指定的xml文件控制了流程中每一步的具体参数，所以要慎重选择。

重点1: XML文件命名解释说明:

• irys/saphyr: 数据来源仪器
• DLE1: DEL1标记系统
• human: 物种是人类
• BG: big genome. 大于5G，主要是优化内存使用
• noES: no extend and split: 即便等位基因里有超过30kbp的结构变异，也不要将他们分开
• haplotype/nonhaplotype: 单倍型优化指的是将那些含有超过500bp或者更大的SV差异的等位基因进行分开，不推荐用于非人类基因组组装是用haplotype，这会导致组装结果过度碎片化，组装的基因组会变大.
• nocut: 不对CMPR(complex multipath regions)进行拆分，所谓的CMPR指的是长度超过130kbp的高度重复序列，因为相似度过高，组装的时候不知道如何处理。

对于非人类的物种，推荐参数为:

1. 除非是小鼠的SV缺失，大部分情况都用nonhaplotype，用于后续的Hybrid scaffold Pipeline(HS)
2. 要noES
3. 是否cut看情况而定。大部分人喜欢不cut。

对于人类, 推荐参数为:

1. 仅在SV检测时用haplotype, 对于HS用nonhaplotype
2. 加上ES
3. 大部分情况下加上CMPR, 除非你知道在CMPR区间上有SV，才使用nocut

重点2: 如何设置组装时pairwise alignment中的-T参数。 基本原则是: 标记每增加一个，p值降低100倍; 基因组每增加一个数量级，p值降低100倍。

• 对于大于1Gb, 标记密度小于 15/100bkp的情况，设置为1e-11,
• 对于基因组大于1Gb, 标记密度大于15/100 kbp，每增加一个标记，就降低100倍，例如17/100kbp, 推荐1e-15

此外可以用-B跳过部分流程,-e则是输出文件的前缀，-x表示在自动去噪后退出。 如果有集群可用参数-C。如果基因组比较差, 可用-R 参数进行初步组装，然后基于第一个版本进一步的组装。还有一些参数用于关闭一些默认启动的功能

• -A: 不将bnx文件和最后的contig比较
• -m: 不将bnx和参考基因组比较
• -E: 不检查输出的完整性

运行过程中, 可以用"grep 'Executing' bionanoAssembly/exp_pipelineReport.txt" 查看执行进度

最后输出结果是"contigs/exp_refineFinal1/EXP_REFINEFINAL1.cmap"，而结果好坏则要看"exp_informaticsReportSimple.txt", 两个核心标准

1. Bionano图谱应该占原来的物理图谱的90%以上
2. Bionano图谱的N50 会由于物种不同有很大差异，动物一般在1M以上，植物不确定。DLE系统差异更明显