一、准备工作
meerkat 0.189版本和以前的版本相比,支持bwa mem 输出的bam文件,还支持全外显子数据count SV。
meerkat原理:参见http://compbio.med.harvard.edu/Meerkat/
1.1 需要准备的软件
1. unix/Linux系统(自带)
2. CMake(自带)
3. PERL 5.8.1及以上(自带)
4. BioPERL 1.5.0及以上(自行安装)
5. R 2.3.1及以上(自带)
6. samtools 0.1.5到0.1.19(不支持新版本samtools)
7. BWA 0.6.2.(已经可以支持新版本的BWA,但是 split read alignment 的时候必须用0.6.2版本)
8. NCBI blast 2.2.24及以上(自行安装)
9. Primer32.2.0及以上(自行安装)
1.2 需要准备的文件
1.参考基因组fasta文件(单独放在文件夹),运行perl脚本,用BioPerl的Bio:DB::Fasta进行处理
#!/bin/perl
use Bio::DB::Fasta; # Create database from a directory of Fasta files
my $db = Bio::DB::Fasta->new('/home/ywliao/utilities/UCSC/hg19_FA');
my @ids = $db->get_all_primary_ids;
2.bwa index 对基因组文件建立的index(实验室已有)
3. samtools faidx 对基因组文件建立的index
samtools faidx hg19ref_order.fa
4.UCSC下载的参考基因注释文件,knowGene.txt 用sort refGene.txt -k 3,3 -k 5,5n > refGene_sorted.txt命令进行sort
sort knownGene.txt -k , -k ,5n > hg19_knowGene_sorted.txt
5.UCSC下载Repeat annotation。(基因注释文件也可以在这里输出)
1.3 照着manual 安装。
下载meerkat压缩包,解压。进入meerkat文件夹。
1.build mybamtools, 生成lib文件夹,文件夹包含着需要链接的动态库
cd ./src/
tar xjvf mybamtools.tbz
cd mybamtools
mkdir build
cd build
cmake ..
make
2.build bamreader
tar xjvf bamreader.tbz
cd bamreader
# Edit Makefile and set BTROOT to the path to which mybamtools was extracted.
#vi Makefile
#BTROOT = /home/ywliao/bin/Meerkat/src/mybamtoolsmake mv ./bamreader ../../bin
结果报错如下,
作如下调试
make clean (清除刚才的安装)
#修改makefile
#from: ... -lbamtools -lbamtools-utils
#to: ... -lbamtools -lbamtools-utils -lz
make
编译成功,但是运行./bamreader 继续报错
解决方法如下
export LD_LIBRARY_PATH=/home/ywliao/bin/Meerkat/src/mybamtools/lib
将mybamtools/lib路径加入LD_LIBRARY_PATH变量即可。
3.build dre
tar xjvf dre.tbz
cd dre
#Edit Makefile and set BTROOT to the path to which mybamtools was extracted.
#vi Makefile
#BTROOT = /home/ywliao/bin/Meerkat/src/mybamtools/
make mv ./dre ../../bin/
4.build sclus
tar xjvf sclus.tbz
cd sclus
make
mv ./sclus ../../bin/
二、预处理
manual明确指出不建议用默认参数
perl ./scripts/pre_process.pl [options]
-b FILE 已经sort和index的bam文件
-k INT 过滤掉的最小的覆盖度(过滤覆盖过多reads的位置,默认500;过滤mapped到着丝粒的reads,通过它显示出的覆盖次数,在肿瘤样品中应该观察拷贝数,应设置一个更高的数值,比如1500,以至于不忽略这些事件
-r INT 被用于计算分布的插入长度的幅度(默认1000),会生成一个pdf的分布图,显示插入片段长度的分布,0关掉这个函数
-n INT 每个read group被用于计算插入片段大小分布的reads数,0 使用全部reads,默认1000
-l INT 提取配对的softclip reads,或者其他配对的,但是有某一个mapped不上或者都mapped不上的reads,默认1。对于插入片段很小的,在sv断点上就会有reads覆盖,这样得到的reads就会部分比对或者比对不上。运行的时候,对于一个末端mapped上,另一个read末端部分比对上的reads对,会把部分比对read的unmapped部分提取出来和mapped的read组成人为的read对;对于一个末端比对上,一个末端unmapped的reads对,那么unmapped read 的起始和末端的序列分别提取和mapped的read组成两对人为的read对;-c 参数就是控制提取的部分的大小,这样人为的reads对重新mapping 到参考基因组。如果插入片段小但是read的长度长,那么就会很大的增加敏感性。对于短长度的read,应设置为0。对于bwa mem 出来的基因组,不需要重新mapping,所以可以关掉这一参数,在meerkat.pl中也一样。
-q INT 削减reads数,等同于bwa 的-q参数,默认15
-c INT 设置开始和末端剪下softclip 或者unmapped 的read的bp数,这些剪下的reads 用来比对参考基因组,寻找更小事件。应轻微小于1/2的read长度,默认参数适合长读长的人类基因组。
-s INT 设置开始和末端剪下softclip 或者unmapped 的read的bp数,这些剪下的reads 用来split reads mapping,必须和下一步meerkat的-s参数设置一样。在不牺牲mapping能力的情况下,值可以设的小一点。应该设置1/5到1/3的read长度。
-u INT 处理uu reads 对(双unmapped reads对,分成4对。默认0。如果测序质量够好,并且基因组没有什么重复的话,对于识别小事件非常有用,人类基因组建议关闭函数。
-f INT clip 比对时允许输出到XA标签的备择比对数量,默认100
-N INT clip和split reads必须Ns阈值,默认是5
-t INT bwa align用到的线程数
-R STR 包含黑名单reads的文件,一个group id 一行,如果对于一个group的单一比对reads少于30%,推荐不出这个group,如果group的
-I STR bwa_index路径,bwa index 生成的参考基因index路径,不是文件,用于bwa align,如果l(L发音)参数设为1的话应设置
-A STR 参考基因的fasta.fai文件,用于bwa align(查看代码发现就是上文提到的samtools建立的参考基因的fai文件)
-S STR samtools路径,如果不存在于环境变量的话
-W STR bwa途径,如果不存在于环境变量的话
-P STR 指定运行步骤,[ all | is | cl ],默认全部
is:提取unmapped,softclip reads,计算插入片段分布
cl: map soft clip 配对reads 到参考基因组,如果使用多线程的话,应分步,cl1运行多线程,cl2运行单线程
-h help
manual中给出的例子。
1. 50bp的reads,<10x TCGA 基因组
建议使用-s 18 -l 0 -q 0
估计50bp片段过小,所以-s 选项 以1/3 read 长度,短长度reads,-l设置为0,估计测序深度不深,所以 并不trimming reads,所以-q 设置为0
2. 101bp reads, 20-30x and 60-80x TCGA 基因组
建议使用-s 20 -k 1500 -q 15
如果是bwa mem出来的文件,建议使用-s 20 -k 1500 -q 15 -l 0
75-101bp的reads,-s 选项应该设置为1/5 read 长度,20,因为人类癌症基因,所以-k选项设为1500,测序深度够深,所以可以设置过滤的basequality为15。bwa mem mapping的数数据-l设置为0
3. TCGA WES 数据
建议使用-s 20 -k 10000 -q 5
-k 10000表示10000的copy number的reads也会留下,-q 5,就是过滤的basequality为5
这次我们实验室分析的数据,150bp 读长,测序深度8x,bwa mem 肿瘤数据,我选择参数为-s 30 -k 1500 -q 0 -l 0
perl /home/ywliao/bin/Meerkat/scripts/pre_process.pl -b $inputfile -k -t -l -q -P is -A $hg19_fai -W $bwa_dir -s -S $samtools_dir perl /home/ywliao/bin/Meerkat/scripts/pre_process.pl -b $inputfile -k -t -l -q -P cl1 -A $hg19_fai -W $bwa_dir -s -S $samtools_dir perl /home/ywliao/bin/Meerkat/scripts/pre_process.pl -b $inputfile -k -t -l -q -P cl2 -A $hg19_fai -W $bwa_dir -s -S $samtools_dir
参考资料
meerkat manual :http://gensoft.pasteur.fr/docs/Meerkat/0.189/Manual_0.189.pdf