发表时间：2019年4月
IF：3.950
单位：
- 威斯康星医学院生物化学系
- 威斯康星医学院生物医学质谱研究中心
物种：人(人体肾脏细胞和蛋白)
技术：肽段清理
一、 概述：（用精炼的语言描述文章的整体思路及结果）
肽段清理对于去除在自下而上（也称为鸟枪法）蛋白质组工作流程中样品制备阶段可能引入的污染物很重要。近些年的研究表明在去除洗涤剂和聚合物污染时，相较于传统的反相洗涤方法，使用羧酸盐修饰的顺磁颗粒有多种益处。但是，也面临实验结果可重复与否的挑战，实验的可重复性限制了这种方法在实验室的广泛实施。为了克服挑战，本研究系统的评估了关键的实验参数，包括如何更好的使用羧酸盐修饰的顺磁颗粒从而使颗粒展现好的性能以及提高肽段的回收。实验结果表明这个标准操作流程SP2能够用于去除肽段样品中的洗涤剂和聚合物污染从而直接纯化样品，使得样品能够直接适用于液相色谱-质谱联用流程。文章显示标准操作流程SP2可用于糖肽和磷酸肽纯化，这个与自动液体处理相兼容的流程适用于样品自动化处理。
二、 研究背景：（简要介绍研究进展动态、研究目的和意义）
在鸟枪法实验流程中，肽段清理对于去除在样品制备过程中引入的污染物很重要。常见的污染物包括洗涤剂，聚合物等。在液相色谱-质谱联用实验中，如果分析的样品含有这些污染物，将会对数据质量、色谱柱和仪器性能产生不利影响。虽然已有样品的在线清理办法，但是离线清理策略才更显优势，因为它使得样品制备和仪器配置更为灵活。标准操作流程SP2就是一种离线肽段样品清理方法。
三、实验设计：
四、 研究成果：（重点图表展示）
1.测定羧酸盐修饰的顺磁颗粒的肽段结合能力
羧酸盐修饰的顺磁颗粒的肽段结合能力是通过在实验中调整微粒和肽段的比例来测定的，即在肽段量一定的情况下加入不同比例的微粒或者在微粒量一定的情况下加入不同比例的肽段。具体的实验结果请见图1。
图 1.（左）肽段的回收率随微粒/肽段的比例的增加而增加，（右）表观结合力（每µg微粒保留的肽段量ng）随微粒/肽段的比例的增加而降低。
2.评价羧酸盐修饰的顺磁颗粒在两种不同肽段缓冲液中的除盐能力
两种缓冲液AmBic和Tris被选择用来测定羧酸盐修饰的顺磁颗粒在肽段缓冲液中的除盐能力。具体的实验结果请见图2。
图 2.（左）当肽段在AmBic或者Tris中消化时的计算回收率，（右）当肽段经过标准操作流程SP2处理后，剩余的AmBic或者Tris缓冲液的计算浓度。
3.评价标准操作流程SP2的各个因素对回收率的影响
肽段回收率与标准操作流程SP2中各个因素的关系，这些因素包括肽段浓度、缓冲液浓度、乙腈起始浓度（特定情况下的标准操作流程SP2可能会用到）、培育时间、洗脱液体积、洗脱时间和洗脱液体积/微粒量的比例。具体的实验结果请见图3。
图 3.（A）肽段回收率随肽段浓度的增加而增加，（B）肽段回收率不随缓冲液浓度的变化而改变，（C）肽段回收率不随乙腈起始浓度的变化而改变，（D）肽段回收率不随培育时间的增加而改变，（E，F）肽段回收率不随洗脱液体积的增加而改变，（G）肽段回收率不随洗脱时间的增加而改变，（H）肽段回收率随洗脱体积/微粒量比例（µL/µg）的增加而增加。
4.标准操作流程SP2在糖肽、磷酸肽和真实样品中的测试
转录后修饰可能改变肽段的理化性质。因此，我们检测了标准操作流程SP2是否适用于糖肽和磷酸肽。实验结果表明，在处理糖肽、磷酸肽和未修饰的肽段的时候，标准操作流程SP2可以作为除了C18方法之外的另一个选择；标准操作流程SP2能去除掉肽段样品中不曾预料到的污染物，即使样品已经被C18方法处理过。正文中展示了糖肽和真实样品的实验结果，请见图4和5。
图 4.（A）经过胰蛋白酶处理过的人血小板反应素-1，人α-1-酸性糖蛋白，人转铁蛋白这三种糖蛋白的序列覆盖和N糖基化位点，（B）注释了的人血小板反应素-1糖肽的EThcD的MS/MS图谱，（C）经过C18方法处理和经过标准操作流程SP2处理的肽段的糖肽和非糖肽的图谱匹配数比较。
图 5.（A）一个TMT标记的免疫沉淀的样品在经过标准流程：胰酶处理、C18清理、TMT标记和再一次C18清理后中污染物的提取离子色谱图（上），经过C18清理的剩余的样品再经过SP2处理的提取离子色谱图（下），（B）C18或SP2清理后残留污染物的峰面积强度，（C）经过SP2清理后污染物倍数减少的柱状图。
5.将标准操作流程SP2应用于自动液相处理工作站的操作考虑
文中用用到的液相处理工作站的型号是：epMotion® 5073m。所有考虑都是基于这个工作站。
6.对标准操作流程SP2用于去除MS不相容洗涤剂的评价
评估使用标准操作流程SP2对于去除强洗涤剂脱氧胆酸钠和月桂基硫酸钠（单独或者混合）和质谱仪相容的表明活性剂（Invitrosol）对于肽段回收实验的重复性以及回收肽段的性质的影响。实验结果表明标准操作流程SP2能用于去除像脱氧胆酸钠和月桂基硫酸钠这样的强洗涤剂，洗涤剂的背景对回收的肽段没有明显影响。
7.标准操作流程SP2的重复性和操作时长考虑
标准操作流程SP2对于肽段清理的重复性极高。在8个技术重复中，当是手动实验时，肽段回收的变异系数为7.4%，当是在自动工作站上实验时，肽段回收的变异系数为4.4%（请见图6）。将消化裂解物制备成直接上机的样品，SP2手动操作1个样品能在10分钟以内完成，1组8个样品能在20分钟内完成。SP2自动操作虽然8个样品的制备需要约40分钟，但是这样解放了实验台上的研究人员。
图 6. 手动和自动标准操作流程SP2中肽段回收和实验重复性比较
文章亮点（与产品的结合点）：
本文章介绍了一种新的标准操作流程SP2，通过这种新的操作流程，我们能够对蛋白质组学分析中的肽段样品进行清理，从而排除污染物的干扰。另外，这个新的操作流程，也可以用于自动化生产，已经在epMotion® 5073m液相处理工作站进行了测试。这一新的操作流程，值得我们部门借鉴。