福尔马林固定石蜡包埋 (Formalin Fixed Paraffin Embedded, FFPE) 样本具有数量多、稳定性高和随访信息完整等特点，成为回顾性癌症研究中极具吸引力的宝贵资源。随着蛋白质组学技术的发展，尤其是4D蛋白质组学的应用，基于FFPE样本的蛋白质组学技术已广泛运用于癌症等疾病研究，极大的推动了疾病的临床过程和疾病机理研究 [1、2、3]。例如华中科技大学同济医学院等合作团队运用景杰生物4D蛋白质组学分析，针对新冠肺炎病毒患者的肺组织FFPE样本进行深度定量，揭示了新冠病毒肺炎免疫应答以及炎症反应调控机制与关键蛋白（PNAS, 2020）。与蛋白质组学相比，修饰组学定量分析对样本量需求更高，针对FFPE样本的修饰组学目前仍然具有非常大的挑战。

 

近日，国际权威期刊Nature Communications(IF=14.9)上发表题为“Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories” 的研究文章。研究针对非小细胞肺癌 (NSCLC) 的FFPE样本，进行了蛋白质组学、磷酸化修饰组学定量分析，为深入了解肺癌和其他类型癌症的发病机制提供了帮助。研究结果同时也突显了FFPE样本进行无偏修饰组学分析的巨大前景，有望对癌症的临床进程做出新的解释。

 

 

 

01 FFPE样本磷酸化修饰组分析的蛋白质提取

 

 

 

从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本中提取蛋白是修饰组学分析的关键。研究人员用非小细胞肺癌（NCSLC）FFPE样本比较了三种已发表的蛋白质提取方案（SDS、SDC和RapiGest），结果显示，SDS-SP3方法鉴定到的整体蛋白质组覆盖度（2917种蛋白）、肺癌相关蛋白质组覆盖度以及可重复性（CV值最低）均最高。此外，前变量（包括福尔马林固定时间，解交联所需95°C加热时间）对蛋白质组及修饰蛋白质组并未产生显著差别。

 

图1.SDS-SP3方法提取肺癌FFPE样本的蛋白质种类最多且与NCSLC相关性最佳

 

02 FFPE样本磷酸化修饰组定量策略
研究进一步对Label Free和TMT标记这两种蛋白质组学定量常见方法进行了系统比较，发现两者在FFPE组织分析方面有不同的优势和劣势。对于相同上样量的样本（每个肽量200 µg），TMT方法获得的蛋白和磷酸化修饰组定量深度高于LFQ 方法，但考虑到标记、分馏和脱盐的额外样品处理步骤，需要相对较高的起始样本量和更多的样品制备时间。与之相比，LFQ只需要少量的样本量进行定量分析和相对较短的样品制备时间（图2a）。因此研究人员建议，LFQ特别适合于微量样本，以及在中等覆盖率下研究数百个样本的大型队列，TMT方法适合20～200例临床FFPE样本，高深度定量研究（图2b）。
图2、FFPE样本磷酸化修饰组定量方法推荐

 

 

 

03 微量TMT分析方法
那么能否减少TMT定量的样本需求量呢？针对这个问题，研究团队开发了一个微量TMT定量方法（microscaled TMT）。每个样本分10个组分以提高鉴定深度。将八个活检等效物（肽量20µg）用TMT（通道1-8）标记，并与2 mg内标物的增强通道（通道11）结合。每个增强通道有助于将信号增加到最小丰度阈值以上，这是获得足够的片段离子以确定TMT标记肽的氨基酸序列和足够的TMT报告离子以在MS2扫描中进行定量所必需的。研究在平均每个TMT-plex定量了超过7000个蛋白质和近8800个磷酸化位点（与TMT方法有近6000个磷酸化位点重叠）。
图3、使用TMT增强剂实现微量样本蛋白质组深度覆盖
04 微量TMT方法的临床分析
最后，研究人员验证了微量TMT方法对FFPE临床穿刺活检样本的检测效果。研究选择了8例非小细胞肺癌 (NSCLC) FFPE穿刺活检样本，其中包括4例腺癌 (ADC) 和4例鳞状细胞癌 (SCC)。结果显示，从8次FFPE穿刺活检样本中定量了近6800种蛋白质，且具有良好的NSCLC相关蛋白的覆盖，磷酸化修饰组最终覆盖范围可以达到超5200个磷酸化位点（图4A、B）。而对比微量TMT方法在临床活检样本和上文活检等效物（肽量20µg）的检测效率来看（图4C、D），两者可定量到相似数量的蛋白质（6792：7137），重叠率为78%。在磷酸化蛋白质组水平上，TMT活检实验中定量到的磷酸化位点数量少于活检等效物（5243：8798），这可能是由于活检和切除组织样本的细胞在组成上略有不同造成的。
图4、FFPE穿刺活检样本的磷酸化修饰组分析
总的来说，该研究系统性地比较了FFPE样本（包括FFPE穿刺活检样本）的蛋白质提取方案、蛋白质组学定量策略和样本量需求，提供了FFPE样本磷酸化修饰组的多种定量方法选择。LFQ定量特别适合研究中等覆盖率的数百个样本的大型临床队列；TMT方法可提供更深的（磷酸化修饰）蛋白质组分析，适合20～200例临床FFPE样本的研究。并尝试提出改进的微量TMT方法，实现对于微量的样本需求实现高通量、高覆盖的磷酸化修饰组学分析。总之，本研究为深入了解肺癌和其他类型癌症的发病机制提供了帮助，体现了临床治疗方案的个体差异性。

景杰生物是中国最具创新活力的蛋白质组学技术应用与开发的领先者，提供多层次、全覆盖的蛋白质组学技术，可对生物与临床样本进行高通量、高灵敏度的深度覆盖蛋白质（修饰）组学技术分析，助力各位老师的研究。

·FFPE样本：4D-FFPE蛋白组&修饰组分析·血液样本：Blood+高深度血液蛋白组定量·单细胞样本：真·单细胞蛋白质组学·高深度定量：TMT高深度蛋白组&磷酸化修饰组分析

 

参考文献：1.F* Coscia,etal.,2019,A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large scale FFPE tissue analysis. bioRxio.2.Monika Oberhuber, et al., 2020,STAT3-dependent analysis revealsPDK4 as independent predictor of recurrence in prostate cancer. Molecular Systems Biology.3.Meng Wu, et al., 2020, Transcriptional and proteomic insights into the host response in fatal COVID-19 cases. Proc Natl Acad Sci U S A.4.Corinna Friedrich, et al., 2021, Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories. Nature Communications.