文献名：Rapid and quantitative protein precipitation
for proteome analysis by mass spectrometry（快速定量的蛋白质沉淀方法用于质谱蛋白质组学分析）
期刊名：J. Proteome Res
发表时间：（2020年5月）
IF：3.534
单位：Department of Chemistry, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada
物种：酿酒酵母
技术：蛋白质沉淀方法
一、 概述：（用精炼的语言描述文章的整体思路及结果）
本研究选取酿酒酵母、通过不同条件的改变，优化了一套回收率较高、时间较短的蛋白沉淀方法。之后通过蛋白定量，凝胶电泳和LC-MS分析具体研究了分离到的蛋白质的数量和性质。文章中通过对盐浓度，孵育温度，丙酮含量及初始蛋白浓度的调节，具体优化构建一套回收率较高，产量较优，时间较短，提取较稳定的蛋白沉淀方法，即室温下以80%的丙酮，100 mM NaCl，孵育2min，以获得高回收率的蛋白沉淀。为后期蛋白质的质谱分析提供更优质的样品蛋白质。
二、 研究背景：（简要介绍研究进展动态、研究目的和意义）
在质谱分析前需要对蛋白进行提取纯化，目前常用溶剂沉淀方法对蛋白质进行分离纯化，多个研究表明丙酮对蛋白具有很好的沉淀作用，常用来纯化组学分析前的蛋白质，但存在回收率低，不稳定等问题，需要对方法进行优化。其中的关键因素是温度，丙酮浓度，孵育时间，盐浓度以及提取蛋白的浓度及性质。本研究通过对这些条件的调节，根据蛋白回收率和回收时间的统计，在不考虑蛋白质分子量、亲疏水性及等电点等因素下，优化了一套高回收率且沉淀时间较短的沉淀方法。
三、实验设计：
四、研究成果：（重点图表展示）
1、对提取的酿酒酵母采用80%丙酮，<1 mM NaCl 溶液，-20°过夜孵育来沉淀蛋白，回收率极低（3 ± 2%），然而当加入>10 mM NaCl溶液时, 蛋白回收率达到98 ± 4%。同时，实验发现，在离子强度足够大的情况下，室温中蛋白回收率也很高，达到99 ± 2%，如图1A所示。图2B展示了不同孵育时间下，NaCl溶液浓度对回收率的影响，可以看到当NaCl溶液达到一定浓度时，时间的增长并不会显著增加蛋白回收率。图1C是对沉淀后蛋白进行凝胶电泳，上部为不加NaCl盐溶液沉淀的蛋白质，下部为加入20mM NaCl溶液沉淀的蛋白质，可以明显看出NaCl盐溶液对于蛋白质沉淀有显著效果。
图1
2、样品的初始蛋白浓度也是影响沉淀蛋白回收的重要因素。图2的实验结果显示，时间对于高浓度当酵母样品的回收率没有影响，对于低浓度蛋白来说，增长孵育（30分钟）时间也能达到较高的回收率，所以优化的高盐/室温沉淀方法同样适用于稀释为0.01 g/ L的低浓度样品。
图2
3、对不同沉淀条件下得到的蛋白质进行质谱检测，得到如图3结果。图3A和3B分别表示-20 °C和室温下不同沉淀时间下鉴定的蛋白数量，发现主要鉴定到的蛋白质在24h孵育条件下沉淀到的，但2min孵育条件下能沉淀到鉴定蛋白的92%。同时图3C显示，室温80%，100 mM NaCl孵育2min和-20°80%丙酮，100 mM NaCl孵育24h两种沉淀方法所鉴定到的蛋白质有70%以上的重叠。图3D显示了两种沉淀方法蛋白质PSM计数之间的强相关性，进一步说明两种沉淀方法对蛋白质的回收效果相似。
图3
4、此外对不同沉淀方法得到的蛋白质性质进行了分析，如图4所示，两种沉淀方法得到的蛋白质的分子量、等电点和GRAVY分数都无显著性统计差异。
图4
5、通过鉴定蛋白质PSM （肽段谱图匹配）的计数，对蛋白质丰度进行量化，发现高丰度的蛋白质在上清液中被鉴定到的概率更高。如图5所示。
图5
五、文章亮点（结论讨论）：
该研究优化了一套蛋白质高效沉淀方法，即在蛋白溶液中加入80%丙酮和高盐溶液（100 mM NaCl），室温孵育2min，经过多次离心，分别收集上清及沉淀，然后再离心后去掉溶液，风干至颗粒。通过对沉淀蛋白进行定量，凝胶电泳以及质谱分析鉴定，证明了该套方法能够高效分离完整的蛋白质，蛋白回收率高，重现性较好，是一种简单、快速且经济的方法，能广泛应用于蛋白质组学、代谢组学和商业蛋白质加工等方面。
阅读人：张霞