(基因功能 & 基因表达调控)研究方案

做了好久的RNA-seq分析,基因表达也在口头溜了几年了,但似乎老是浮在表面。

对一件事的了解程度决定了你的思维深度,只想做技工就不用想太多,想做大师就一定要刨根问底。

老是说基因表达,那么什么是基因表达?我们测序得到的基因表达其实只是一种表型,是样本的一个快照,和普通的身高体重之类的连续型表型类似。

常规的转录组分析本质上都是表型分析,clustering、pseudotime、DEG、marker,在这些分析中,每个基因都是独立的维度,属于静态的分析,此时我们关注的是某个基因的功能分析,比如RET,功能已经明确,那就可以用基因表达这个表型来解释另一个表型。

高通量测序还会有后续的分析,几万个基因不可能一个一个的研究,GO和KEGG分析就来了,基因不是互相独立的,GO term和pathway的概念就来了。GO和KEGG的本质是规范了基因之间的关系。GO整合了所有物种,是从生命系统的角度来统一基因的关系,这种关系只是一个集合;KEGG是针对一个物种来界定基因之间的关系,这种关系是有向图结构。必须再深入了解GO和KEGG的制作原理,暂时不深入。此时我们开始区分基因类型,蛋白编码、非编码、转录因子。在这个阶段我们更关注的是基因之间的调控关系

中心法则揭示了生命系统的层级和管道结构,和计算机的通信系统很类似,就算上游的基础调控再复杂,下游的蛋白都是决定性因素,所以令人惊叹的是上游调控如此复杂多变,可下游的蛋白确是非常稳定,这说明复杂多变的调控是非常稳定的。

 

基因研究的第一步必然是基因的功能,其次才是基因的调控。

 

基因功能 

那么如何研究一个基因的功能呢?参考:#基因组观#基因功能研究的“七大绝招”与“三板斧” - BioinforCN

简单总结一下这篇文章:

1. 天地人和,研究基因表达的时空规律来推测功能,这和侦探调查是一样的,属于间接推理;

2. 患得患失,就是直接操作基因,knock out或down或overexpress,来直接探索基因的功能,属于直接观察;

3. 上下求索,因为中心法则是个层级和管道系统,上下游十分明确,从基因的DNA、RNA到蛋白质,一起研究;

4. 十面埋伏,立体论证,做生物的很容易观察到假阳性,必须多角度论证;

5. 其他的,misexpression、in vitro/vivo。

 

不说人类hs了,假设你负责一个全新的物种的基因组和基因功能研究,你如何找到该物种的所有基因呢?

看任何一篇基因组组装文章都能找到解决方案。那我们就看看严建兵的最新的玉米的NG吧,Genome assembly of a tropical maize inbred line provides insights into structural variation and crop improvement

微信文章:《Nature Genetics》| 玉米产量相关基因找到了 | 热带玉米基因组及高精度结构变异图谱成功构建,助力玉米遗传改良

首先是基因组DNA的组装,Genome sequencing, assembly and scaffolding,这部分纯技术,以后估计都不要组装了,直接把基因组测出来;

其次就是基因组注释了,Genome annotation,这部分是我们现在最感兴趣的部分,如何找到一个新物种内的所有基因?

A comprehensive strategy combining de novo gene prediction, protein-based homology searches, RNA sequencing (RNA-Seq) and isoform sequencing (Iso-Seq) of nine tissues (Supplementary Table 6) was used to annotate the genes (Supplementary Fig. 7).

方案来了:

1. 基因是有特殊结构的,所以只要有DNA序列,就可以做denovo预测;

2. 中心法则告诉我们DNA、RNA和蛋白质是环环相扣的,所有测RNA-seq和iso-seq可以间接推出基因;

3. 蛋白测序还没有普及,所以目前都用的同源蛋白序列来反推;

这样注释出来的只是很general的基因注释,能cover绝大多数基因,但某些特殊结构的肯定无法注释出来。

有了草图,后面再做实验的功能研究就会方便很多。

基于高通量测序的前两步只能告诉你基因组的这个地方是个基因,但是不可能告诉你它的功能;第三步就是基于已有的知识了,做同源推理。所以目前来看所有的生物知识都是来源于实验的,测序只是一个加速的辅助手段而已。

可以没有测序,但是不能没有实验,测序是科研加速的催化剂。

文章结果:

(基因功能 & 基因表达调控)研究方案

 

GENE FINDING METHODS - broad institute - 很全面

 

基因表达调控/转录调控

教科书解释:

  1. 染色体和染色质水平的结构变化,导致基因活性变化;
  2. 转录水平调控;
  3. RNA加工水平调控,剪切修饰编辑降解;
  4. 转录后,细胞核向细胞质转运;
  5. 翻译水平;
  6. 蛋白合成水平;

目前最火的两个可以用高通量测序研究的调控方法:

  • 转录因子,enhancer,promoter
  • 非编码RNA,lncRNA、miRNA、ceRNA

参考:

Modes of transcriptional regulation

Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease

 


问题:

1. RNA-seq的建库方案有哪些?ployA、随机等。只抓有polyA的MRNA会有哪些优势和缺点?

2. 细胞核和全部测序的区别?

3. 基因的长度差别到底有多大?

4. 可变剪切和isoform是如何影响蛋白的?

5. KEGG里面已经有基因的关系了,为什么我们还要研究基因调控?

6. 蛋白互作网络的用途和局限性是什么?

7. 蛋白是唯一的决定性因素吗?是的,绝大多数DNA和RNA层面的变化都会最终改变蛋白的功能。比如HSCR的无法形成ENS就是一个复杂的表型,可以肯定的是某些蛋白的功能执行紊乱了。

8. 基因表达的高低重要,还是基因表达的on/off重要?

9. 基因是如何找到和定位的?基因的编码的蛋白是如何确定的?

10. 如何理解基因之间的关系,是什么性质的关系?

11. 如何立即基因的拷贝数对基因表达的影响?

12. transposable-element对基因表达的影响?

13. 基因的经典结构是什么样的?什么是CDS和UTR?可以结合目前主流的基因预测工具来看。

14. 转录调控和蛋白互作有什么联系和区别?

 

Typical structure of a mature eukaryotic mRNA (AUG, UAA/UAG/UGA)

(基因功能 & 基因表达调控)研究方案

 

 

待续~

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