《初入实验室的学问与技巧》第二讲《设计且完成一个课题》

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一、设计课题的原则

课题的确定和开题报告

  • 自己命题
  • 导师帮助研究生命题
  • 导师给研究生题目
  • 参与师兄师姐的课题
  • 联合培养等

重点是无论怎么命题,都要把现在的题目高高兴兴完成了。

二、读文献

  • 本实验室的文献:特别是近三年的
  • 与自己研究课题密切相关的文献
  • 根据自己的特点和能力建议和提出课题
  • 综述自己感兴趣的科学问题

在做实验的过程中理解你的工作

三、已知课题,设计思路

  • 了解课题的科学意义
  • 了解课题的应用价值
  • 理解课题的关键科学问题
  • 拟采用的关键技术和方法
  • 想获得的结果与达到的目标

范例

Tau蛋白与DNA的相互作用》

一、课题开展第一步:确定神经细胞核是否有Tau蛋白?

进一步:分离出细胞核,里面确实有Tau蛋白。(用多种方法,一种比一种精确)

再进一步:动物脑内细胞核里有Tau蛋白。

再进一步:必须证明没有Tau蛋白的细胞核内,没有Tau蛋白。

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以上的工作仅仅证明了细胞核存在Tau蛋白,还没有到DNATau的结合。

  1. 最简单的凝胶电泳——与Tau结合的DNA迁移变慢,并且发现Tau与DNA的结合无序列选择性——如何结合?
  2. 首先研究DNA与Tau蛋白的结合特点。(这一步很难也很关键,很多人死在了这一步)
  3. 原子力显微镜检测tau与长链DNA的结合
  4. 电子显微镜发现神经tau与DNA相互作用形成“复合物小体”或“串珠样模型”。

but,还是仅仅止步于Tau能够与DNA结合,并形成“结合小体”。

究竟Tau蛋白与DNA是如何结合的,需要进一步证明。

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  1. 发现DNA与Tau的最小结合单位为13bp(方法没看懂,不重要),还要进一步确定
  2. 原子力显微镜显示正结果,也是13bp。还应该证明Tau蛋白在DNA上的结合部位。证明Tau蛋白应该结合在DNA大沟,还是小沟?——这一步很难,怎么做?注意分析DNA的结构,什么样的分子会结合在大沟上,什么样的分子会结合在小沟上,为什么?(这样思考除了探究可能的方向,也能启发我们的实验方法)知识:大沟可以有很多种排列组合,有特异性结合位点,因此结合的大多都是一些调控DNA功能和表达分子。小沟的结构比较单一,因此缺乏特异性结合位点,连接的是其他分子。【注意与其他知识的串联】《初入实验室的学问与技巧》第二讲《设计且完成一个课题》
  3. 猜测结合的是小沟,因此用distamycin A先结合DNA,然后发现Tau的结合受到了抑制。——应该进一步证明Tau蛋白结合在DNA小沟上。
  4. Dnase实验进一步验证了DNA小沟是Tau蛋白的结合位点。——工作还不完善,还需要进一步验证。——还没有排除DNA大沟结合的可能性。
  5. 加了甲基蓝(和大沟结合),Tau仍然结合——说明大沟不结合Tau。Methyl G排除了DNA大沟的可能性。——工作还不完善,还需要进一步验证。——Tau蛋白的哪个domain与DNA结合还不知道呢。
  6. 通过Tau蛋白突变体的克隆、表达、分离、纯化,采用MESA证明:微观结合结构域和脯氨酸丰富结构域共同参与DNA的结合。【蛋白质分离纯化特别麻烦,是必须学的技术,由此也可以想想,什么是我必须学的技术】——哪些氨基酸参与了结合?
  7. 通过干扰,发现两个结构域上的lysine参与了结合。——如果是Lysine参与了结合,哪些条件影响其结合?【不只是苛刻的要求,也是对证据的补强】
  8. 发现碱性条件干扰结合,即静电作用。——Tau蛋白与DNA结合,究竟有什么生物学意义?【这看上去像一开始问的第一个问题,但其实也不是。在已经深入研究之后,也许发现了更为深入的意义,也许还要进一步探索,这不是课题的意义,而是你所探究的这个现象在现实中存在的合理性】
  9. 结果发现:Tau蛋白与DNA结合可以形成”似球状“小体,Tau被磷酸化就不会形成小体,而只有形成小体的才不会受*基攻击解体。也即,Tau蛋白具有保护DNA免受*基的攻击损伤。
  10. 可以写论文了,但在论文写作过程中,还需要补充实验。

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  1. 新的发现:为什么之前是13bpDNA双链上,同一个方向上有两个小沟的最短长度是13bp,只有Tau结合在一个方向上才会掰弯DNA,把DNA拖慢【实验对自己的思维进行了补强,又产生了新的想法,同时,这也需要一点想象力】

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通过这个研究,我们的收获

  • 分子克隆、表达,包括突变体的制做等
  • 蛋白质分离纯化技术,包括离子交换、亲和层析等
  • 蛋白质印迹(Western blotting)
  • 细胞培养,细胞核的分离等技术与方法
  • 免疫组织化学方法等
  • 抑制剂的选择与应用等
  • 荧光标记、光学显微镜,包括共聚焦显微镜等
  • 原子力显微镜、电子显微镜等
  • 氧*基的测定、细胞凋亡,包括流式细胞仪等
  • 荧光分光光度议、紫外分光光度议等仪器设备
  • 动物饲养、野生型、KO-Tau转基因型动物等

  • 论文
  • 学位
  • 理解了论文中的科学问题
  • 掌握了相关技术与方法
  • 内心经受了磨砺
  • ……

Ps. 其他感悟

发论文时应该尽可能多的受到训练

生命科学体现出来结构与功能的高度一致性,同时各种实验技术也是在以各种方式逼近结构,猜测功能,这一点对我的工作是否有所启发。

技术非常重要,实验的细节决定成败。

耐心耐心再耐心,你以为不必要的每一个步骤都不能省。

PPS.图片都是赫老师PPT的,请勿转载。

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