1.混合测序基础
测序成本虽然下降了，但对于植物育种应用研究来说还是很高，动不动就上百群体，小小植物个体价值又低，测完了很可能后面就用不到了。这时，混合样本测序是一种省钱的好办法。
混池测序（Pool-seq）相对于GWAS或其他精细定位策略而言，其实是一个初定位产品，其结果很有可能是跟性状相关的候选区域。
概念：
混合样本测序一般是选择表型极端或目标性状差异的个体混合，构建一个文库进行测序。
原理：
假设每个样本被测到的概率相等，通过测序reads数计算等位基因频率。如果基因与研究性状有关，那么理想情况下，表型差异显著的混合样本中，该基因等位基因频率差异显著。
不足：
- 大群体的等位基因频率才能代表该群体真实的情况，选择少量样本可能带来选样误差；
- 各样本测序量不均一引入新的偏差。
但研究表明，在大样本量混合且提高测序深度的情况下，混合样本能够准确评估等位基因频率。
影响因素及建议：
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群体类型：群体类型决定研究背景是否纯，影响定位的精确性。混合样本测序最好是只有目标性状存在差异，其他性状一致，即遗传背景纯，一般永久群体>临时群体>自然群体。
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混合样本量：多态性高的群体（如F2），推荐混合样本量>100；多态性低的群体（如BCF），推荐混合样本量>20；且作图群体选择比例<25%。
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亲本选择：两个亲本尽量性状差异单一，杂合位点少。
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混合样本的均一性：样本量小的时候影响大，样本量大影响小。
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表型：表型统计不准确，或由多个微效基因控制，会引起定位效果不佳。
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参考基因组：基因组组装好坏，基因组注释情况，物种连锁不平衡强易导致候选区域过大。建议采用组装到染色体水平的参考基因组。
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测序错误：混合样本测序比较难通过算法区分是测序错误还是稀有变异，测序深度高能有效降低影响。
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测序数据量：测序数据量推荐50X以上，测序深度高有利于检测到多态的SNP位点。
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比对：混合样本无法校正比对错误，CNV会影响等位基因频率统计。
2. 点突变检测
对于隐形纯合点突变，效果较好。
MutMap和MutMap+是利用SNP-index算法，需要参考基因组，如果目标位点位于参考基因组没有组装上的gap区，或是参考基因组不具有的序列中，利用MutMap检测方法就不能有效检测到目标突变位点。
MutMap-Gap方法结合了MutMap和de novo组装。先通过MutMap分析SNP-index peak区，发现找不到跟突变性状相关的基因，再将之前比对不上参考基因组的野生型亲本unmapped reads和MutMap分析中SNP-index peak区域的野生型亲本比对上的reads一起进行de novo组装，获得潜在的新基因，并以此为参考再计算SNP-index，检测目标突变位点。
3. BSA
BSA（Bulked segregant analysis，混合分组分析），利用目标性状存在极端表型差异的两个亲本构建分离群体，在子代分离群体中，选取两组表型差异极端的个体分别构建混合池 ，结合高通量测序技术对混合样本测序，比较两组群体在多态位点（SNP）的等位基因频率（AF）是否具有显著差异，定位与目标性状相关联的位点并对其进行注释，研究控制目标性状的基因及其分子机制。
SNP-index是主流的BSA定位算法。其原理是构建子代分离群体，经过挑选极端性状构建混池后对SNP进行检测，对各混池进行等位基因频率分析，并与其中一个亲本进行比较。与此亲本不同的基因型所占的比例，即为该位点的SNP-index。
（注意这里的reference并不是变异检测的参考基因组，而是构建群体所使用的亲本，所以SNP-index计算高度依赖于亲本测序数据。）
两个混池相减（上图右）得到了△SNP-index的结果，即两个混池之间SNP基因型频率的差异。理论上说，不与性状相关的位点，△SNP-index的值应当在0左右，代表混池之间不存在差异；而QTL及其相连锁位置的SNP，△SNP-index值应当呈现较高的数值。
△SNP index会存在因统计偏差造成的假阳性位点，可以通过计算滑窗内所有SNP的△SNP-index，来消除其影响，得到真正QTL所在的基因组区域。
其他算法如欧几里得距离(ED)，Gradedpool-seq（Ridit检验）等。
这里的BSA是指狭义上的QTL-seq，针对有主效基因的数量性状。实际上上面的质量性状/点突变性状、InDel-seq（InDel突变性状）以及下面的BSR，都属于BSA的范畴，原理相似。此外还有QTG-seq。相应的Pipeline可参考：http://genome-e.ibrc.or.jp/home/bioinformatics-team/mutmap
4. BSR
BSR（Bulked segregant RNA sequencing）同样依据分组混合的原理，在RNA水平上进行高通量测序并定位候选基因，即BSA+RNAseq。BSR的混池同样选取分离群体中的极端性状单株，混池用的单株数会比BSA多一些（大多大于30），提取RNA进行混池，再进行转录组测序，mapping参考基因组后同样进行变异分析，确定候选区间。BSR的优势在于不仅提供变异信息，还能提供候选区域中基因的表达信息。
BSR的劣势：RNAseq只能检测表达基因上的SNP，检测的SNP数量少，一般只适用于高频的SNP。同时由于存在RNA编辑等问题，RNA层面检测的SNP和DNA层面也是有差别的，所以只有当DNA层面无法实现（复杂基因组）或DNA测序成本过高（超大基因组）等情况下可选择BSR，否则还是优先选择BSA。
5. 混合样本GWAS分析
Pool –GWAS也是一种省钱策略，但还是非常小众。
比如：GWAS study using DNA pooling strategy identifies association of variant rs4910623 in OR52B4 gene with anti-VEGF treatment response in age-related macular degeneration
Pool –GWAS研究复杂遗传背景的性状功效降低，对稀有变异的检测能力下降。
6. 混合样本驯化研究
同样，分析获得的驯化相关位点很多，如果想用类似的方法检测复杂性状相关位点，后续挖掘真正的功能位点的难度还是很大。
7. 小结
Ref：
华大科技公众号《混合样本测序，这些“坑”记得跳过！》《经典案例 | 我的研究适合“混合测序”吗？》
BSA专题——分析方法大汇总
美吉生物公众号《BSA的姊妹产品——BSR》
BSA的原理
没看过这些文章，请不要尝试BSA定位 | 群体研究
混池测序研究中如何不被这些问题困扰？