文献名：Proteomic Profiling of Rhabdomyosarcoma-Derived Exosomes Yield Insights into Their Functional Role in Paracrine Signaling（源于横纹肌肉瘤的外泌体的蛋白质组学分析用于深入了解其在旁分泌信号转导中的作用）
期刊名：Journal of Proteome Research
发表时间： （2019年8月）
IF：3.78
单位：
- 黎巴嫩大学，黎巴嫩
- 贝鲁特美国大学儿童和青少年医学系，黎巴嫩
- 德州理工大学化学与生物化学系，美国
物种：儿童横纹肌肉瘤细胞系
技术：外泌体提取、蛋白提取、免疫印迹、蛋白消化、LC-MS/MS定量、MRM定量、PANTHER分析、Pathway Studio分析
一、 概述：（用精炼的语言描述文章的整体思路及结果）
本研究利用质谱分析手段对儿童横纹肌肉瘤（RMS）细胞系中提取出的外泌体内所含蛋白进行比对研究，利用PANTHER和Pathway Studio软件分析外泌体蛋白参与的被扰乱生物过程及变化途径。结果显示，源于RMS的外泌体携带一种有助于多细胞系间保守的细胞信号网络构建，同时，对RMS外泌体的特异性蛋白需要进一步的评估，寻找作为该肿瘤的全新生物标志物的可能性。
二、 研究背景：（简要介绍研究进展动态、研究目的和意义）
外泌体是分泌到细胞外具有生物活性的小泡，除了在细胞间通讯中起主要作用外，还参与多种不同的功能、途径。分泌的外泌体可以进入全身循环并到达不同的组织，这使它们成为良好的诊断工具。另一方面，蛋白质组学分析在染色体外转运、信号转导和生物标志物研究等领域得到了广泛的应用，从人脑脊液中分离出的外泌体的蛋白质组学特异性确定了一组蛋白质，这些蛋白质可作为神经系统疾病和脑损伤的生物标志物。
在之前的研究中，该课题组使用了一组人类RMS细胞系来表征RMS的外泌体的miRNA含量，除了发现在来自ARMS和ERMS两种亚型的外泌体之间差异，功能分析还显示，RMS来源的外泌体对受体癌和正常细胞的增殖有积极作用，同时还能诱导正常成纤维细胞的迁移和侵袭，促进内皮细胞的血管生成。因此，RMS来源的外泌体是促进受体细胞侵袭性的重要角色。除了以前关于外泌体mRNA和miRNA变化的研究外，最近的研究还确定了外泌体的蛋白质载体在介导转移表型方面具有重要作用。本研究结果发现了可能有助于RMS旁分泌信号的新的外泌体蛋白，其可在未来的临床研究中作为潜在的RMS生物标志物。
三、实验设计：
四、研究成果：（重点图表展示）
1、对提取的外泌体蛋白质进行了LC-MS/MS蛋白质组学分析。细胞系内重现性良好，从三种ERMS系：JR1、RD、Rh36来源的外泌体中分别检测到243、289、364种蛋白质。其中，有161种共有蛋白质。对于ARMS系Rh30和Rh41来源的外泌体，共检测到157和242种蛋白质，其中122种为共有蛋白质。综合对比，5种细胞系共有蛋白80种，ERMS系独有81种，ARMS系独有42种。
2、MRM-MS分析法对LC-MS/MS结果的验证：通过RD、Rh36分别与JR1来源外泌体的比例，采用MRM分别对ERMS来源外泌体中的45种常见蛋白进行了定量分析。RD和JR1比较，两种细胞系之间差异表达了6种蛋白质，Rh36和JR1比较，差异表达共20种蛋白质（q-value≤0.05）。同时使用了免疫印迹法来验证结果。
3、RMS来源的外泌体中常见的蛋白质所关联的独特分子和生物学功能：使用PANTHER基因分类系统，对80种常见蛋白质进行分析。结果表明：4个主要的分子功能基团是催化、结合、结构和受体活性；28％的蛋白质（n = 47）参与了包括50％的细胞通讯，24％的细胞周期和16％的细胞成分运动的细胞过程；另外27种蛋白质（占所有蛋白质的16％）参与了代谢过程，其他确定的功能组包括细胞成分的组织或生物发生（n =18，11％），定位（n = 17，10％），发育过程（ n = 12，7％）和免疫系统（n = 12，7％）。可得结论：这些外泌体蛋白的分子功能和生物学意义是明确的，主要是参与旁分泌信号功能，以及在癌症生长和侵袭中重要的细胞周期和细胞通讯功能。
4、不同细胞系的外泌体蛋白与常见的癌症相关生物通路：PANTHER分别分析了每种RMS细胞系的外泌体蛋白质含量，并确定了受各个蛋白质网络影响的共同和特有通路。结果表明，不同细胞系的外泌体蛋白共同拥有大部分生物通路。来自3种ERMS细胞系的外泌体蛋白共有79条共同通路，来自2种ARMS细胞系的外泌体蛋白共有82条共同通路，而来自所有5种细胞系的外泌体蛋白质共有64条共同途径。其中，15个最显著的通路与肿瘤细胞的侵袭、增殖和转移有关，例如细胞增殖、凋亡、分化、细胞粘附、细胞迁移、转移和血管形成。同时，有15和18种通路是ERMS和ARMS的外泌体蛋白分别独有的，主要与ARMS中的免疫调节和炎症以及ERMS中的细胞粘附、迁移和肿瘤发生有关。综上，即使不同RMS细胞系的外泌体中的蛋白质可能不同，但仍会在一系列常见的通路中有相似的功能。
5、利用Pathway Studio关注与细胞浸润、细胞迁移和肿瘤转移相关的特定通路，将所识别的外泌体蛋白联系起来，这样的蛋白质网络显示出所涉及蛋白质之间的高度相关性。三种通路之间共同享有几种蛋白质，这进一步证实了这些蛋白质在与侵袭和转移相关的细胞功能中的重要性。
6、与来自其他细胞类型的外泌体蛋白数据库比对，RMS外泌体既包含重叠蛋白也有不同蛋白。使用公开的外泌体蛋白质数据库ExoCarta将识别出的蛋白质组与正常细胞和其他肿瘤细胞的外泌体识别出的蛋白质组进行比较。结果发现，RMS外泌体与正常（非癌细胞）细胞外泌体共有32％（S.D.±16）的蛋白质；与癌症来源的外泌体蛋白质有50％重叠（S.D.±15）。另外，有83种在RMS来源的外泌体中识别出的蛋白质在正常细胞来源的外泌体中尚未发现，有63种在其他肿瘤类型的外泌体中尚未发现。其中，36种蛋白质在RMS外泌体中特异表达，这些蛋白质作为RMS的潜在生物标记物有待进一步研究的特别关注。
五、文章亮点（结论讨论）：
该研究在充分调研外泌体蛋白基础上，利用质谱方法和数据分析手段对RMS细胞系的外泌体蛋白进行深度挖掘分析，探究并验证了外泌体在细胞信息传递中的重要作用，发现了可能有助于RMS旁分泌信号的新的外泌体蛋白，同时发现了一系列具有潜在生物标志物应用能力的蛋白，对于进一步研究探索，发现与癌症相关的生物标志物具有重要的意义。
阅读人：孙国莹
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.9b00157