牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应。在导致牛乳过敏反应的蛋白中，β-乳球蛋白（β-LG）被认为是主要的过敏原。采用共价修饰技术降低β-LG抗原性已成为国际乳制品加工技术研究的重点。但常用共价修饰手段如糖基化、磷酸化等随机修饰，存在修饰位点选择性低、稳定性不理想、修饰产物不均一等问题。研究表明β-LG抗原性同时受线性表位和构象表位影响，共价修饰发生在不同位点会对蛋白构象及抗原性产生不同影响。为明晰不同位点共价修饰对β-LG抗原性的影响，实现共价修饰对β-LG抗原性的有效调控，需采用定点修饰技术以制备均一化修饰产物。
在PEG蛋白修饰常用基团中，巯基因其含量少成为PEG定点修饰中的理想位点，目前针对β-LG巯基使用PEG定点修饰的鲜见报道。并且β-LG第121位半胱氨酸（Cys121）游离巯基位于被97%人血清识别的主要抗原表位肽段AA102-124中，游离巯基或是探究不同结合位点对β-LG抗原性影响及实现β-LG致抗原性调控的关键位点。
因此，针对β-LG Cys121游离巯基，选择5 kDa单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺（mPEG-MAL）对其进行定点修饰（图1），以期获得高修饰率β-LG PEG定点修饰产物，并对修饰前后β-LG抗原性进行探究。
修饰前后β-LG抗原性分析
研究显示PEG修饰能有效降低蛋白免疫原性，然而本实验经mPEG-MAL对β-LG Cys121游离巯基定点修饰后，β-LG-MAL抗原性显著提高约25.9%，如图2所示。本团队前期采用PEG定点修饰β-LG谷氨酰胺残基得到产物β-LG-NH2，β-LG-NH2抗原性显著下降59.04%；对β-LG的N-末端氨基进行修饰得到β-LG-ALD，β-LG-ALD抗原性显著下降53.8%，该2 种位点修饰使蛋白抗原性下降原因都归结于PEG链对于蛋白的空间屏蔽作用，掩盖了β-LG表面部分抗原决定簇。
图2
本实验中，PEG的巯基定点修饰却没有因PEG链的屏蔽使抗原性下降，说明结合位点对β-LG抗原性的影响较PEG链的屏蔽作用更为显著。β-LG中肽段AA41-46、AA102-124和AA149-163为主要抗原表位，分别为92%、97%、89%的人血清识别。实验中Cys121游离巯基位于被97%人血清识别的主要抗原表位肽段AA102-124中，并且由于β-LG致敏性同时受线性表位和构象表位影响，因此可能是修饰后原处于蛋白内部的致敏位点暴露，或者有新的构象致敏表位形成导致β-LG致抗原性显著提升。
巯基-聚乙二醇-酰肼SH-PEG-HZ
叔丁氧羰基氨基-聚乙二醇-醛基Boc-NH-PEG-CHO
聚己内酯-聚乙二醇-醛基PCL-PEG-CHO
醛基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯基CHO-PEG-SC
碘乙酰基-聚乙二醇-硫辛酸IA-PEG-Lipoic acid
氯化物-聚乙二醇-硫辛酸Chloride-PEG-Lipoic acid
氮杂二苯并环辛炔-聚乙二醇-硫辛酸DBCO-PEG-Lipoic acid
环辛烯-聚乙二醇-硫辛酸TCO-PEG-Lipoic acid
四嗪-聚乙二醇-硫辛酸Tetrazine-PEG-Lipoic acid
胆固醇酯-聚乙二醇-硫辛酸CHEMS-PEG-Lipoic acid
羧基-聚乙二醇-羟基COOH-PEG-OH
活性酯-聚乙二醇-羟基NHS-PEG-OH
炔基-聚乙二醇-羟基AlKyne-PEG-OH
巯基-聚乙二醇-羟基HS-PEG-OH
生物素-聚乙二醇-羟基Biotin-PEG-OH
酰肼-聚乙二醇-羟基HZ-PEG-OH
硅烷-聚乙二醇-羟基Silane-PEG-OH
丙烯酸酯基-聚乙二醇-羟基AC-PEG-OH
硫辛酰胺-聚乙二醇--羟基LA-PEG-OH
对甲苯磺酸-聚乙二醇-羟基Tosylate-PEG-OH
乙酰硫基-聚乙二醇-羟基Acetylthio-PEG-OH
氨基氧基-聚乙二醇-羟基Aminooxy-PEG-OH
硝基苯基碳酸酯-聚乙二醇-羟基NPC-PEG-OH
琥珀酰亚胺酰胺琥珀酸-聚乙二醇-羟基SAS-PEG-OH
羟基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺羧甲基酯OH-PEG-SCM
琥珀酰亚胺戊酸酯-聚乙二醇-羟基SVA-PEG-OH
环氧化物-聚乙二醇-羟基Epoxides-PEG-OH
戊酸-聚乙二醇-羟基Valeric Acids-PEG-OH
丙烯酰胺-聚乙二醇-羟基ACA-PEG-OH
溴基-聚乙二醇-羟基Br-PEG-OH
乙烯砜-聚乙二醇-羟基VS-PEG-OH
甲基丙烯酸酯基-聚乙二醇-羟基MA-PEG-OH
碘酸盐-聚乙二醇-羟基IA-PEG-OH
氯化物-聚乙二醇-羟基Chloride-PEG-OH
氮杂二苯并环辛炔-聚乙二醇-羟基DBCO-PEG-OH
环辛烯-聚乙二醇-羟基TCO-PEG-OH
四嗪-聚乙二醇-羟基Tetrazine-PEG-OH
叶酸-聚乙二醇-羟基FA-PEG-OH
胆固醇酯-聚乙二醇-羟基CHEMS-PEG-OH
甲氧基聚乙二醇-羟基mPEG-OH
羟基-聚乙二醇-乙酸叔丁酯OH-PEG-CH2COOtBu
乙酰基巯基-聚乙二醇-羟基S-Acetyl-PEG-OH
多巴胺-聚乙二醇-羟基DA-PEG-OH
聚赖氨酸-聚乙二醇-羟基PLL-PEG-OH
聚(乳酸-共-乙醇酸)-聚乙二醇-羟基PLGA(10K)-PEG-OH
小编：axc西安齐岳