解螺旋公众号·陪伴你科研的第2095天

高分文献都在用的Kymograph analysis，运动粒子分析必备技能！
2019年9月Cell发表了一篇重磅研究【1】，该研究鉴定出定位于少突胶质细胞的高尔基体“前哨”细胞器的的特异性标记物TPPP（Tubulin polymerization promoting protein），揭示了TPPP在髓鞘形成等方面的重要功能以及微管组织方式的详细分子机制。作者通过Kymograph analysis发现少突胶质细胞具有均匀的微管极性，即85%–92%的微管远离细胞胞体生长：


Kymograph analysis是用来分析粒子运动方向的方法，例如2017年Kononenko NL通过Kymograph analysis观测囊泡的运动情况【2】。

今天半夏就给大家分享使用ImageJ进行Kymograph analysis！

1

软件准备及Macro安装

ImageJ下载链接：https://imagej.nih.gov/ij/ 。Fiji下载链接：http://fiji.sc/Fiji 。KymographClear宏下载链接：https://drive.google.com/file/d/0B1Ea2O-bSM0naXdHdlBSVUczUGs/view 。
KymographClear宏的安装，将下载好的KymographClear.txt放置于ImageJ macro toolset文件夹，重启ImageJ软件即可：

2

Kymograph analysis分析步骤

1. 打开ImageJ软件的KymographClear宏，其菜单如下：
2. 通过菜单的第一个按钮可以打开图像序列，有两种图像序列打开方式：打开图像序列并计算平均强度（快捷键F1）或打开序列并计算最大强度图像（快捷键F2）：
以第二种方式打开图片序列：
然后选择要打开的图像范围(如果要打开整个序列，只需按OK)：
显示的图像序列与最大强度显示如下：
3. 定义kymograph分析轨迹
通过Segmented line tool（分段线工具，快捷键F3）追踪需要进行分析的轨迹，可以通过Image –> Adjust –> Brightness/contrast调节对比度亮度以实现轨迹的最佳可视化。
通过使用鼠标重复单击来创建与粒子轨迹重叠的分段线，完成后双击或右键单击(请注意，线条的起点将是kymograph分析的原点)：

单击宏工具集上的样条线按钮或键入快捷键F4来样条化选择的轨迹：
4. Kymograph analysis
点击Kymograph按钮或输入F5快捷键：
Kymograph宏中可选择生成kymograph线条的宽度，推荐宽度为5：
Kymograph analysis得到五个新的图形，Kymograph可以显示粒子运动或静止情况：
前向运动(左)、后向运动(中心)和静态粒子(右)的图形如下：
RGB彩色图像红色表示向前运动，绿色表示反向运动，蓝色表示静态粒子：
Kymograph位置是沿着水平的(定义轨迹的第一个点在左侧)，并且时间是沿着垂直的(时间零对应于顶部)：
5. 估计背景
为了估计绝对粒子强度，需要估计接近所选轨迹的图像背景。使用多边形选择工具（Polygon selections）在所选轨迹周围新建多边形选框：

点击Background button：
名为background.txt的文件现在保存在“kymograph”文件夹中。此文件包含为序列中的每个图像选择的区域的平均像素值。此文件可用于校正背景：
6. 数据分析
数据分析软件KymographDirect下载链接：www.nat.vu.nl/~erwinp/downloads.html 。
打开KymographDirect软件，其界面如下：
打开Kymograph文件夹下ImageJ分析得到的Kymograph_1.txt文件：
点击Forward可以分析向前运动的粒子的速度及其他指标：
可分析的指标有：
例如粒子运动速度随时间的变化如下：
点击Backward可以分析向后运动的粒子：
右击导出分析数据即可：
今天给大家分享使用ImageJ进行Kymograph analysis就到此为止，希望对大家有所帮助！

参考文献:

1. Fu MM, McAlear TS, Nguyen H, et al. The Golgi Outpost Protein TPPP Nucleates Microtubules and Is Critical for Myelination. Cell. 2019;179(1):132-146.e14.

2. Kononenko NL, Claßen GA, Kuijpers M, et al. Retrograde transport of TrkB-containing autophagosomes via the adaptor AP-2 mediates neuronal complexity and prevents neurodegeneration. Nat Commun. 2017.